Ponentes
Descripción
La aplicación de herbicidas en actividades agrícolas es una práctica muy común, pero su acumulación y sus productos de degradación en el medio ambiente pueden ejercer un efecto negativo sobre el ecosistema. La degradación bacteriana, además de ser la principal ruta de degradación de herbicidas, ofrece la posibilidad de disminuir o destruir diversos contaminantes empleando la actividad biológica, para la transformación de compuestos xenobióticos en una fuente de energía o nutrientes. Esta investigación tiene por objetivo evaluar la tolerancia, determinar la concentración inhibitoria mínima de bacterias Escherichia coli (E. coli) ambientales al glifosato y su potencial de degradación utilizándolo como única fuente de fósforo, la cual se cuantificará mediante la técnica de inmunoensayo (ELISA). Por ello las bacterias fueron expuestas a altas concentraciones de glifosato presentando todas inhibición de crecimiento, se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de 2 cepas de Escherichia coli aisladas de los arroyos de la cuenca del río Paraná provenientes de zonas agrícola y urbana, además de una cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922. Las cepas fueron testadas en un rango de 40 a 0.31 mg.mL-1 en donde la cepa de E. coli ATCC 25922 presentó un valor de MIC más alto (40 mg.mL-1) en comparación a las cepas aisladas de los arroyos (20 mg.mL-1). Sin embargo, no se mostró evidencia de biodegradación de glifosato en las condiciones del experimento. Esto sugiere que las bacterias no pudieron descomponer el compuesto de glifosato en sus partes constituyentes o metabolizarlo de manera efectiva. Los resultados obtenidos indican que las bacterias exhibieron tolerancia a concentraciones superiores a los límites reglamentarios de glifosato en agua, pero carecieron de capacidad para degradarlo.
Resultados
Como resultado de la prueba cualitativa, las soluciones de 30 mg.mL-1, 35 mg.mL-1, 40 mg.mL-1 fueron caracterizadas con actividad positiva, es decir con halo de inhibición alrededor de los oxford cups.
La concentración inhibitoria mínima se determinó como la concentración más baja del glifosato que demuestra la inhibición del crecimiento de E. coli sin exhibir ninguna coloración visible por el cloruro de trifenil tetrazolio (indicador de respiración celular que se tiñe de rojo en presencia de células vivas), mientras que también obtiene la densidad óptica más baja en comparación con el control positivo de la prueba (inhibición del crecimiento inducida por fosfomicina).
Las bacterias provenientes de los arroyos Acarymi y Entre Rios presentaron una concentración inhibitoria mínima de 20 mg.mL-1.
La cepa de E. coli ATCC 25922 presentó un valor de concentración inhibitoria mínima más alto (40mg.mL-1), en comparación a las cepas E. coli aisladas de los arroyos por lo tanto los resultados reflejan que las bacterias ambientales son menos tolerantes que la E. coli ATCC 25922 proveniente de muestra clínica en las condiciones del experimento.
Fue evaluada la capacidad de las 3 cepas bacterianas de degradar el glifosato a una concentración inicial de 4 ppb. Fueron tomadas muestras en los días 0, 1 ,2, 3 y 4. A diferencia de lo que hallaron Muhhamad et al., (2022), que indican que la Escherichia coli posee capacidad degradadora de glifosato como fuente de carbono produciendo AMPA y glioxilato con capacidad de biodegradación del 92% en condiciones de laboratorio, los resultados de la prueba de biodegradación en el presente estudio utilizando medio de cultivo con glifosato como única fuente de fosforo, mostraron que no hubo una degradación del glifosato por parte de las cepas de E. coli. Por lo tanto, en esta investigación no se le atribuyo capacidad de metabolizar glifosato por la vía de la sarcosina
Introducción
Desde la introducción de los cultivos genéticamente modificados resistentes a herbicidas a base de glifosato en 1996, su aplicación ha aumentado exponencialmente, siendo el pesticida más utilizado en el sector agrícola en los últimos años. La mayoría de los herbicidas a base de glifosato no están aprobados para su aplicación en ambientes acuáticos, sin embargo, con su uso generalizado hay múltiples rutas a través de la cual puede ocurrir la exposición de los organismos. Esto abre campo para la investigación de estrategias para la remediación de cuerpos de agua contaminados con glifosato.
La degradación bacteriana, además de ser la principal ruta de degradación del glifosato, ofrece la posibilidad de disminuir o destruir diversos contaminantes empleando la actividad biológica, utilizando organismos vivos o sus componentes para la transformación de compuestos xenobióticos en una fuente de energía para su metabolismo . El impacto del glifosato frente a bacterias ubicuas como Escherichia coli, así como en las comunidades microbianas en un contexto de vida acuática, aún no está claro. Si bien son numerosos los estudios sobre la biodegradación de glifosato por bacterias aisladas de suelos poco se ha analizado el potencial de degradación de bacterias acuáticas.
Conclusión
La evaluación cualitativa de la tolerancia reveló que todas las cepas de la bacteria Escherichia coli analizadas fueron tolerantes a altas concentraciones de glifosato, considerando que fueron sensibles a concentraciones mucho mayores a los limites regulatorios en agua en Paraguay (0,7 mg/L).
Se determinó que la concentración inhibitoria mínima del glifosato para las cepas E.coli que presento variación con respecto a la procedencia de la cepa, siendo la E.coli ATCC 25922 la cepa en presentar un valor de concentración inhibitoria mínima superior con respecto a las aisladas de los arroyos naturales de la cuenca del río Paraná. Los resultados referidos y los datos de la bibliografía señalan que la concentración inhibitoria mínima de glifosato varía entre las cepas de la bacteria. Este hallazgo indica que diferentes cepas pueden tener diferentes niveles de susceptibilidad al glifosato teniendo en cuenta también la influencia del medio y el tipo de glifosato utilizado.
El estudio no mostró evidencia de biodegradación de glifosato en las condiciones del experimento. Esto sugiere que las bacterias no pudieron descomponer el compuesto de glifosato en sus partes constituyentes o metabolizarlo de manera efectiva.
Metodología
Fueron reactivadas cepas bacterianas obtenidas del banco de bacterias del laboratorio de agua y sedimentos de la Itaipú Binacional, preservadas a -20 °C en glicerol 20%, se seleccionaron las bacterias de los arroyos denominados Acaraymi y Entre Ríos provenientes de áreas urbana y agrícola respectivamente. Se utilizó la cepa de referencia E. coli ATCC 25922 organismo control procedente de un aislado clínico recomendado para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (Minogue et al., 2014).
Las cepas puras de E. coli aisladas en agar cromogénico (Brilliance™ E.coli/coliform, CM0956, Oxoid, UK), se cultivaron en medio líquido R2A modificado sin fosforo, medio desarrollado por Reasoner y Geldreich en 1985, que imita las condiciones de bajo contenido de nutrientes del agua de superficie, agua de pozo y aguas residuales.
Se evaluó la tolerancia de las bacterias a altas concentraciones de glifosato comercial (sal monoamónica de glifosato 75,7 % p/p PLATOON WG), mediante la técnica de difusión en agar y la utilización de oxford cups, que brindaron resultados cualitativos que fueron interpretados como sensibles o tolerantes.
En el caso de las bacterias, la concentración inhibitoria mínima de los herbicidas se refiere a la cantidad más baja de herbicida necesaria para inhibir el crecimiento de una bacteria determinada en condiciones de laboratorio (EUCAST, 1998). No existe un procedimiento estandarizado para probar la concentración inhibitoria mínima de los herbicidas. Por lo tanto, la concentración inhibitoria mínima de glifosato sobre los extractos bacterianos fue determinada utilizando la metodología de Suheil y Fehmey (2009), adaptado a las condiciones de cultivo del estudio, en donde por microdilución en caldo fueron testadas concentraciones desde 40 mg/ml a 0.31 mg/ml.
La prueba de biodegradación se realizó en muestras cultivadas en medio líquido R2A con 4 μg/L, equivalente a 4 ppb, incubadas en oscuridad a temperatura ambiente (25°C) en condiciones de agitación (150 rpm) durante 4 días. Se extrajeron alícuotas de 1 ml de cada tubo por cada día del ensayo, las cuales se conservaron en tubos eppendorf a -20 grados hasta el momento de la determinación. La determinación cuantitativa de glifosato en las muestras se realizó mediante ELISA de la marca ABRAXIS, un ensayo colorimétrico del tipo competitivo.
Objetivo
Evaluar la tolerancia, determinar la concentración inhibitoria mínima de glifosato contra bacterias Escherichia coli ambientales y su potencial de degradación utilizándolo como única fuente de fósforo.
| Area | Ciencias Agrarias y Ambientales |
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